激光共聚焦顯微鏡的應用以及操作步驟介紹

激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源，在傳統光學顯微鏡基礎上采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計算機對所觀察的對象進行數字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統。主要包括激光光源、自動顯微鏡、掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器）、數字信號處理器、計算機以及圖象輸出設備等。

 

主要用于組織切片、活細胞的熒光標記、三維圖像重建分析研究；細胞生物物質、離子的定性、定量、定時和定位分布檢測等；多重熒光觀察；長時間活細胞觀察；對材料進行反射光直接觀察和共聚焦成像掃描，可對顯微圖像進行普通熒光和DIC成像記錄和分析。

 

激光共聚焦顯微鏡操作步驟：

 

1.根據熒光探針的激發和發射波長選擇合適的激光，激光功率，光譜濾光片和發射濾光片。

 

2.確定掃描方法：點，線，面，3D掃描。

 

3.確定掃描密度（分辨率）：256×256,512×512,1024×1024,2048×2048，分辨率越高，掃描速度越慢，圖像信噪比越好，但越多可能會發生光漂白。

 

4.選擇共焦顯微鏡物鏡的倍數和電子放大倍率：確定此條件后，確定掃描范圍，物鏡的透光率與數值孔徑（NA）的四次方成正比，并且物鏡放大倍數的平方。因此，反比例，應盡可能選擇具有高數值孔徑的物鏡。

 

5.根據樣品的制備質量，選擇合適的針孔尺寸，調節激光管電壓，光電倍增管功率，降噪等，達到最佳狀態。這些參數的選擇或設置非常緊密，應該全面考慮。

 

6.確定光線切割范圍，即掃描樣品的厚度，起始位置和結束位置。

 

7.給出了由光切割的層數和拍攝時的累積平均次數。

 

8.獲取圖像并保存。